產品名稱：博萊黴素 Zeocin

博萊黴素 Zeocin 和 鹽酸博萊黴素兩種

該產品為Invitrogen原裝 整盒（8支*1.25ml） R25001

產品關鍵詞：

Zeocin 博萊黴素（博來黴素）；Phleomycin 腐草黴素；Sh ble基因；Streptomyces verticillus 輪枝鏈黴菌；Hygromycin B 潮黴素B；G418遺傳黴素；CAS NO.：11006-33-0

基本描述：

Zeocin™是博來黴素/腐草黴素（bleomycin/phleomycin）康生素家族的成員之一，從輪枝鏈黴菌Streptomyces verticillus中分離得到，對細西菌、珍菌（包括酵母菌）、植物和哺乳動物細胞具很強的毒性。來自Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因賦予Zeocin抗性。

Zeocin™是腐草黴素D1的商業名稱，一種堿性、水溶性、銅離子螯合的糖肽康生素。銅離子的存在使得溶液為藍色，此銅螯合的形式為無活性。一旦進入細胞後，二價銅離子（Cu2+）被還原為一價銅離子（Cu+），並被細胞內的巰基化合物去除。銅離子被去除後，Zeocin™被活化，嵌入DNA使其斷裂，樶終導致細胞死亡。

抗性基因：

Zeocin™抗性由編碼一種13,665Da大小蛋白的Sh ble基因（Streptoalloteichus hindustanus bleomycin gene）賦予，該蛋白化學計量方式結合Zeocin™，抑製其DNA雙鏈切割活性。因此，能表達此蛋白的真核和原核宿主細胞被賦予Zeocin™抗性。

基本特性：

1）CAS NO.：11006-33-0

2）化學式：C55H83N19O21S2Cu

3）分子量：1137.41 g/mol

4）外觀：藍色溶液（100mg/ml in deionized，autoclaved water）

5）運輸：冰袋運輸

6）保存：-30°C~-10°C，至少1年有效

7）大腸杆菌篩選：25-50μg/mL（低鹽LB培養基，NaCl濃度不能超過5g/L）

8）酵母菌篩選：50-300μg/mL（YPD或基本培養基）

9）哺乳動物細胞篩選：50-1000μg/mL（合適培養基，根據細胞係而不同）

注意事項：

1）Zeocin™對光敏感，需將康生素，或含該康生素的平板或培養基置於黑暗處。

2）降低西菌培養基的鹽濃度，調整pH到7.5使其保持活性，因高離子強度和酸或堿性都會抑製Zeocin™活性；

3）儲存Zeocin™在-30°C~-10°C，使用前需冰上融化。

4）Zeocin™有毒，為了您的按全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。

使用方法（應用舉例）：

1）大腸杆菌（E. Coli.）

宿主：不能包含Tn5轉座子（比如：Top10，DH5，DH10）

培養基：使用低鹽LB（10g Trypton，5g NaCl，5g Yeast extract），pH 7.5，防止Zeocin™失活

選擇濃度：25-50μg/mL用於大腸杆菌篩選

2）酵母菌（Yeast）

宿主：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,畢赤酵母（Pichia pastoris）

培養基：含1M山梨醇的YPD（電轉化細胞）；YPD或基本培養基（化學轉化細胞）；測試培養基調pH到6.5-8.0，選擇pH值允許使用樶低濃度Zeocin™。

轉化方法：電轉法，使用鋰離子步驟或使用EasyComp試劑盒。不能使用原生質體用於酵母轉化，因Zeocin™會引起完整細胞死亡。

選擇濃度：50-300μg/mL，取決於酵母菌類型、培養基pH和離子強度。建立殺滅曲線確定能殺死未轉化宿主細胞的樶低Zeocin™濃度。

3）哺乳動物細胞（Mammalian cells）

50-1000μg/mL用於篩選穩定轉染細胞係（平均常用濃度為250-400μg/mL）。取決於細胞係，需要2-6周用Zeocin™篩選得到穩轉集落（foci）。進行穩轉株正式篩選前，需確定能夠殺死所有未轉染宿主細胞的樶低Zeocin™濃度。

1） 確定細胞對Zeocin™的敏感性

2）篩選穩定轉染細胞係

篩選小技巧：若是細胞對Zeocin™耐性更強，可用含Zeocin™培養基進行細胞分盤，並置於37°C孵育2-3h，使得細胞貼壁。然後將細胞置於4°C，2h。記得使用Hepes作為培養基的緩衝體係。重新將細胞置於37°C孵育。4°C孵育細胞的目的是短時間內終止細胞分化，使得Zeocin™能發揮作用，殺死細胞。

應用圖片【Zeocin™篩選下的HEK293細胞】：

HEK293細胞用含10% FBS，1mM L-穀氨酰胺和400μg/mL雙抗的培養基，分別在添加和未添加400μg/mLZeocin™的培養基選擇培養。

圖1，未經Zeocin™篩選的HEK293細胞。

圖2，經Zeocin™篩選3天後的HEK293細胞。隨著質膜破裂，往細胞外延伸長出長臂（long appendages）。（見實心箭頭標注）

圖3，經Zeocin™篩選3天後的HEK293細胞。細胞開始破裂，培養基內發現細胞顆粒。（見空心箭頭標注）

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